squarix ME043.1說明書 

目錄號編號ME043.1（RPA.1）(1 mg)

目錄號編號ME043.2（RPA.2）(5 mg)

羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 芐酯

• Fe2 + 特異性熒光“傳感器”
• 線粒體特異性
• 線粒體可螯合鐵池的測定
• 線粒體鐵攝取評估
• 病理狀態(tài)下線粒體可螯合鐵池改變的評估
• 線粒體可螯合鐵對生理和病理細胞過程的作用評估
• 鐵減少評估

熒光“鐵傳感器”RPA 和 RDA 選擇性測定活細胞線粒體可螯合鐵

鐵對許多生物過程至關(guān)重要，但也是有害的，因為它促進產(chǎn)生高度破壞性的氧物種。線粒體可螯合鐵被認為是導(dǎo)致幾種人類疾病。過去，由于線粒體蓄積不足或鐵選擇性指標的細胞分布均勻，試圖測定可螯合鐵的線粒體內(nèi)池存在問題 (Lit 3)。熒光無毒的“鐵傳感器”RPA 和 RDA 是一個，它允許在單個完整線粒體中特異性地確定這種鐵池。它們是評估不穩(wěn)定（“氧化還原活性”）鐵功能的新工具，例如在自由基參與的細胞和組織損傷過程中。

產(chǎn)品信息

RPA 作為生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產(chǎn)率熒光標記物。透膜化合物的陽離子熒光團允許通過例如熒光顯微鏡進行觀察，并且基于線粒體的負膜電位，特別是靶向活細胞的線粒體。在無細胞系統(tǒng)中，RPA 熒光 (max 601 nm) 被 Fe2 + 離子強烈化學(xué)計量淬滅。

1,2

1

0,8

0,6

A

例如：564 nm 發(fā)射：603 nm

120 B

100 ·

80 ·

60

RPA (µM)

• 45

0,4

30

40

20 · ·

0,2       20

0 0

· · ·

· · · · ·

450 550 650 750

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18

FAS (µM)

A：無細胞系統(tǒng)中 RPA（20 MRPA 的“簡單緩沖液”(SBS)：2 mM 抗壞血酸鹽、0.15%SDS 和 10 mM Tris/HCl，pH 8.2）的吸光度和發(fā)射光譜。

B：Fe2 + 對“SBS”中 RPA (20-45 M) 熒光的影響：Fe2 +，作為添加的儲備液 (1 mM) 中硫酸亞鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物 (FAS) 濃度的增加添加。含 20 mM 抗壞血酸鹽，與培養(yǎng)基混合。在 RPA/Fe2 + 復(fù)合物*形成后 2 min，測定含已知濃度 RPA 和 Fe2 + 的培養(yǎng)基部分的熒光（以任意單位 a.u. 表示）。零熒光等于無染料培養(yǎng)基的熒光。

RPA 選擇性蓄積在培養(yǎng)肝細胞的線粒體中 (Lit 1,2)。當(dāng)鐵以膜滲透形式加入細胞時，線粒體內(nèi) RPA 熒光被淬滅。當(dāng)實驗可用的線粒體可螯合鐵時，其增加

加入透膜過渡金屬螯合劑吡哆醛異煙酰腙和 1,10-二氮雜菲后，膜透性降低。這種 RPA 熒光的增加允許使用離體原位校準 (Lit 1) 特異性定量活細胞中的線粒體可螯合鐵。

在細胞系統(tǒng)中的應(yīng)用

RPA 可按 Lit 所述使用。1. 在蓋玻片或 Pentz 小室培養(yǎng)的活細胞與 RPA（0.01-10µM，由 10µM 或 1 mM DMSO 儲備液制備）在 HBBS（“Hanks 平衡 sot 溶液”）中于 37 ℃ 孵育 10-12 min。隨后用無染料 HBBS 清洗細胞 3 次。為了避免 RPA 與小室結(jié)合并改善線粒體負荷，RPA 負荷后應(yīng)將細胞轉(zhuǎn)移到第二個（無指示劑）Pentz 小室，再孵育 15 min。在 37 °C 條件下。現(xiàn)在應(yīng)在 37 °C 條件下用適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基（例如肝細胞用 HBBS 或 L-15 培養(yǎng)基）覆蓋細胞。使用例如定量激光掃描顯微鏡測定線粒體內(nèi) RPA 熒光。RPA 的紅色熒光在 exc. = 543 nm 處激發(fā)，并通過 exc. = 601 nm 附近的長通濾光片收集。定量和定性測量的掃描參數(shù)取決于用于實驗的顯微鏡系統(tǒng)。通過加入 FeCl3/8-羥基喹啉復(fù)合物 (5-15µM) 或膜滲透性鐵螯合劑，例如 PIH（吡哆醛異煙酸腙，2 mM）或 1,10-二氮雜菲 (2 mM)，開始測定后 5-10 min 可控制可螯合鐵的線粒體內(nèi)水平。對于對照測量，平行培養(yǎng)物上樣含有相同熒光團的鐵不敏感對照 RPAC（羅丹明 B-[（菲-9-基）氨基羰基] 芐基酯）。應(yīng)使用與上述相同的加載條件。

原位校準

通過比較 PIH (2 mM)“去淬滅”后的線粒體熒光（任意單位）與溶解在“線粒體培養(yǎng)基”中的 RPA 標準品 (5-80µM) 的熒光，測定線粒體內(nèi) RPA 濃度的離體校準（組成見文獻 1）。為了獲得校準曲線，將 100µl 已知 RPA 濃度的培養(yǎng)基部分置于細胞實驗中使用的相同蓋玻片上。在無細胞離體測量中，使用與細胞熒光定量測量相同的焦平面和激光掃描參數(shù)。

Fe2 + 誘導(dǎo) RPA 熒光猝滅的離體標定

1 mL“線粒體培養(yǎng)基”（見 Lit.1）轉(zhuǎn)移至 1.5 mL 試管中，37 ℃ 孵育。加入 RPA (20-80µM)。加入新鮮制備的含 20 mM 抗壞血酸鹽的貯備液 (1 mM) 中已知濃度的 FAS（硫酸亞鐵銨/檸檬酸三鈉鹽二水合物）。RPA/Fe2 + 在應(yīng)用期間形成。2 min 孵育時間。通過使用與細胞熒光定量測量和離體校準相同的焦平面和激光掃描參數(shù)測量 RPA 熒光，獲得校準曲線。

產(chǎn)品數(shù)據(jù)

產(chǎn)品名稱： RPA

產(chǎn)品代碼： ME043.1 (1 mg) 和 ME043.2 (5 mg)

化學(xué)名稱： 羅丹明 B-[（1,10-二氮雜菲-5-基）-氨基羰基] 芐酯

分子式： C48H44N5O4Br

分子量： 834g/mol

大吸收： max (log) = 564 nm (4.95) ,510-535 寬肩峰

發(fā)射大值： 大值 601 nm

穩(wěn)定性： < 4 ℃，干燥避光儲存

外觀： 紫色固體

純度： > 97% (1H NMR，500 MHz)

淬滅化學(xué)計量學(xué)： RPA/Fe2 + :3:1[mol/mol]

體外毒性： 無毒

使用注意事項

該產(chǎn)物作為生物樣品中 Fe (Ⅱ) 的選擇性、高量子產(chǎn)率熒光標記物，尤其是在活細胞的線粒體中。可通過熒光光譜法、熒光板進行測量  讀者，  FACS，  視頻顯微鏡  和  激光掃描顯微鏡。  可在 DMSO 中制備 1 mM-5 mM RPA 儲備液，等份試樣應(yīng)在-20 ℃ 避光保存。當(dāng)在-20 ℃ 下適當(dāng)儲存時，溶液可使用至少 2-3 個月。

訂購信息

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文獻

1. 用新型熒光傳感器選擇性測定活細胞線粒體可螯合鐵；

F. Petrat 等人生物化學(xué)。J. (2002) 362,137-147

1. 冷誘導(dǎo)的肝細胞凋亡：非線粒體可螯合鐵觸發(fā)的線粒體通透性轉(zhuǎn)換；U. Rauen et al.《自由基生物學(xué)與醫(yī)學(xué)》2003 年第 35 卷第 12 期第 1664-1678 頁
2. 活細胞中的可螯合鐵池：系統(tǒng)確定的量；F. Petrat et al.生物學(xué)化學(xué)，第 383 卷，第 489-502 頁，2002 年
3. 利用不同鐵結(jié)合親和力的線粒體選擇性熒光鐵指示劑評估可螯合線粒體鐵。U. Rauen 等人ChemBioChem 2007,8,341-352
4. 線粒體烏頭酸酶的氧化失活導(dǎo)致大鼠原代中腦培養(yǎng)物中鐵和 H2O2 介導(dǎo)的神經(jīng)毒性。David Cantu 等人PlosOne，2009 年 9 月，第 4 卷，第 9 期，第 1-9 頁
5. Tryparedoxin 過氧化物酶缺陷使錐蟲發(fā)生鐵噬型細胞死亡。M. Bogacz 等人細胞生物學(xué)，2018 年 7 月
6. 線粒體鐵蛋白限制氧化損傷調(diào)節(jié)線粒體鐵的有效性：Friedreich 共濟失調(diào)的保護作用假說。Alessandro Campanella 等人嗯。摩爾遺傳學(xué)2009,Jan 1;18 (1) :1-11
7. 紅細胞對非轉(zhuǎn)鐵蛋白鐵的攝取。Eugenia Prus 等人貧血。2011;2011:945289
8. 線粒體鐵螯合可預(yù)防癲癇發(fā)作誘導(dǎo)的線粒體功能障礙和神經(jīng)元損傷。Li-Ping Liang 等人神經(jīng)科學(xué)雜志 2008 年 11 月 5 日，28 (45) 11550-11556
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10. 阿霉素的心臟毒性是通過線粒體鐵蓄積介導(dǎo)的。Yoshihiko Ichikawa 等人心臟病學(xué)。臨床研究雜志2014 Feb 3;124 (2) :617–630.
11. 鐵螯合劑用于治療和預(yù)防缺血事件后的細胞死亡和器官損傷。Hossein Ardehali 等人2016 年。US20170014397A1，
12. 線粒體鐵和能量功能障礙將成纖維細胞和誘導(dǎo)的神經(jīng)元與泛酸激酶相關(guān)的神經(jīng)退行性變患者區(qū)分開來。Paolo Santambrogio 等人疾病神經(jīng)生物學(xué)，第 81 卷，2015 年 9 月，第 144-153 頁
13. Shawn 是 SLC25A39/40 的果蠅同系物，是一種促進神經(jīng)元存活的線粒體載體。Jan R. Slabbaert 等人神經(jīng)科學(xué)雜志 2016 年 2 月 10 日，36 (6) 1914-1929。
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16. Friedreich 共濟失調(diào)，人淋巴母細胞和成纖維細胞中線粒體不穩(wěn)定鐵無變化。

F. Petrat 等人，J. biology。化學(xué)280,8,February 25,pp. 6701–6708,2005

1. 選擇性抑制細胞質(zhì)而不是線粒體核糖體的氨基糖苷類設(shè)計者表現(xiàn)出耳毒性降低。Timor Baasov 等人，J. biol。化學(xué)289/4，第 2318–2330 頁。2014-01-24