支原體是細胞培養(yǎng)物的常見和嚴重污染物。已顯示  30%-87%的細胞培養(yǎng)物感染支原體。許多支原體污染，特別是在連續(xù)細胞系中，生長緩慢，不破壞宿主細胞，但仍能夠影響各種參數(shù)，導(dǎo)致結(jié)果不可靠或錯誤。這些影響包括代謝、生長、活力、DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成以及形態(tài)的變化。支原體檢測是確保準確研究和可靠生物技術(shù)產(chǎn)品的必要質(zhì)量控制工具。

e-Myco™（版本2.0）產(chǎn)品是一組引物，旨在檢測是否存在可能污染生物材料（如培養(yǎng)細胞）的支原體。常規(guī)

• e-Myco™支原體PCR預(yù)混液：PCR條中的藍色沉淀
• 對照DNA：無色透明液體
• 去DNase/RNase水：無色透明液體

No 目錄 組成 25235 25236

• 隨著時間的推移，PCR抑制物質(zhì)可能在細胞培養(yǎng)基中蓄積。
• 血清超過10 ~ 12%的培養(yǎng)基對PCR等下游應(yīng)用有抑制作用。而且，細胞培養(yǎng)基中的常規(guī)材料酚紅很可能發(fā)生交叉反應(yīng)，從而干擾PCR中的信號。
• 這些負面影響可以通過使用Myco-Spin支原體提取試劑盒進行樣品制備來克服。
• 為此，建議純粹從樣本中分離基因組DNA，以確保分析的準確性和重復(fù)性。

1. 制備200 μL細胞培養(yǎng)材料，然后轉(zhuǎn)移至新的1.5 mL微管中
2. 向樣品管中加入200 μL Buffer ML1，20 μL Proteinase K和5 μL RNase ASolution
    

用于檢測支原體的技術(shù)涉及在選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)樣品，

這需要至少1周才能獲得結(jié)果，而通過用該引物組進行PCR，這是基于保守的16S rRNA，在數(shù)小時內(nèi)獲得檢測結(jié)果。再者，如果你想知道詳細的物種，你可以從你設(shè)計的引物進行PCR和測序。采用的8-甲氧基補骨脂素(8-MOP)用于消除污染DNA的模板活性。已知8-MOP在波長320-400 nm入射光光光活化后嵌入雙鏈核酸，形成共價鏈間交聯(lián)。構(gòu)建該產(chǎn)品的內(nèi)部對照以識別假陰性  結(jié)果  in  每個  反應(yīng)。以下  內(nèi)部  設(shè)計對照  in  此類  a  方式   的

e-Myco™

1 支原體PCR預(yù)混物

3 不含DNase/RNase

水

< 0.01%熱啟動Taq DNA聚合酶

< 0.01%dATP、dTTP、dGTP、dCTP

< 0.005%支原體引物，內(nèi)部對照

< 0.001%8-MOP（溶于DMSO）

從豬鼻支原體污染的培養(yǎng)人細胞中提取的基因組DNA < 0.01%。

無模板對照

< 去DNase/RNase水

48T 8T

25 μL x 3T 25 μL x 1T

并通過倒置或移液充分混合。

3. 將裂解物在56 ℃（預(yù)熱的加熱塊或水浴）下孵育10 min。
4. *裂解后，向上層樣品管中加入200 μL Buffer ML2，充分混勻。
5. 向裂解液中加入200 μL無水乙醇，輕輕顛倒5-6次或吸液混勻。請勿渦旋。混合后，短暫離心1.5 mL試管，除去蓋子內(nèi)部的液滴。

樣本引物對用于擴增內(nèi)部對照和靶DNA，通過大小進行區(qū)分。e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）包含PCR的所有組分，模板除外：i-StarTaqTM DNA聚合酶、dNTP、10x緩沖液、引物、8-MOP和支原體部分基因擴增的內(nèi)部對照。因此，您可以添加模板并進行PCR反應(yīng)。

• 預(yù)混型：該e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）包含PCR反應(yīng)的所有組分。您只需添加模板DNA或樣本。
• 廣義種屬檢測：您可以檢測五種常見的細胞培養(yǎng)-感染支原體以及其他各種支原體
• 菌種確定：您可以通過對擴增的PCR產(chǎn)物進行測序來確定支原體的菌種。
• 內(nèi)部對照品：產(chǎn)品中嵌入的外源性內(nèi)部陽性對照品可防止可能由錯誤PCR檢測引起的誤判。
• 消除殘留污染系統(tǒng)：8-MOP溶液可防止PCR產(chǎn)物的殘留污染。
• 僅供研究使用，不用于診斷程序。

e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）的開發(fā)、設(shè)計和銷售僅供研究使用。預(yù)期不用于人類或動物疾病診斷。不得在人或動物體內(nèi)或體外使用。在將其用于其他目的之前，用戶必須按照適用法律、指令和法規(guī)確認系統(tǒng)。

• 移液器和移液器吸頭（氣溶膠屏障）•Myco-Spin支原體提取試劑盒
• 熱循環(huán)儀 •渦旋混合器
• 一次性手套 •加熱塊

• 保存條件：接收后-22~-18 ℃保存。
• 有效期：e-Myco™支原體PCR檢測試劑盒（版本2.0）在適當(dāng)?shù)膬Υ鏃l件下可儲存長達12個月，性能和質(zhì)量均未降低。產(chǎn)品包裝盒上標有失效日期。

6. 在不潤濕邊緣的情況下，小心將全部裂解物轉(zhuǎn)移至旋轉(zhuǎn)柱（2 mL收集管中），蓋上蓋子，并以13,000 rpm離心1 min。棄去濾液，將旋轉(zhuǎn)柱置于2 mL收集管中（重復(fù)使用）。
7. 向色譜柱中加入700 μL緩沖液MWA，并以13,000 rpm離心1 min。
8. 在不潤濕邊緣的情況下，向色譜柱中加入700 μL緩沖液MWB，并以13,000 rpm離心1 min。棄去流穿液，將色譜柱置于2.0 mL采集管中（重復(fù)使用），然后再次離心1 min以干燥膜。*丟棄穿柱管和收集管。
9. 將旋轉(zhuǎn)柱置于新的1.5 mL試管（未提供）中，并將50 μL緩沖液ME直接置于膜上。在室溫下孵育1 min，然后以13,000 rpm離心1 min以洗脫。

1. 在1.5 mL試管中制備供試細胞培養(yǎng)物的細胞懸液。然后用一般計數(shù)方法計數(shù)細胞數(shù)。每次檢測至少需要5 x 104個細胞。

注：強支原體感染只需10 ~ 100個細胞即可檢出，而弱感染需要5000 ~ 50000個細胞以上的細胞。您可以根據(jù)您懷疑的感染率稀釋模板。我們建議您在制備直接上清液的系列稀釋液后進行PCR反應(yīng)，以獲得結(jié)果。

2. 將計數(shù)的細胞（超過5 × 104個細胞）轉(zhuǎn)移至1.5 mL試管中。在微量離心機中旋轉(zhuǎn)10-15秒。小心倒出上清液。
3. 將細胞重懸于1 mL無菌PBS或DPBS溶液中進行清洗。
4. 在微量離心機中旋轉(zhuǎn)10-15秒。小心倒出上清液。

[選項]再次重復(fù)該清洗步驟。

5. 將細胞沉淀重懸于100 μL無菌PBS或DPBS溶液中。

注：如果您希望獲得結(jié)果，使用PBS溶液優(yōu)于Tris(10 mM，pH 8.5)、TE(10 mM Tris，0.1 mM EDTA)或高壓滅菌DW。

6. 在95 ℃下加熱樣品10 min，渦旋5-10 s。然后，使用臺式離心機（室溫）以13,000 rpm離心2 min。
7. 將一等份加熱上清液轉(zhuǎn)移至新試管中。該上清液將用作PCR的模板。