NiHC：用于基于片段的藥物發現的高親和力多鎳 NTA 傳感器芯片

XanTec bioanalytics專門制造與市場上所有主要表面等離子共振 (SPR) 儀器品牌兼容的高質量傳感器芯片。通過不斷的研究，XanTec 開發了當今可用的*泛的傳感器芯片組合，為幾乎所有應用提供量身定制的解決方案。

基于片段的藥物發現 (FBDD) 已成為高通量篩選 (HTS) 的替代方案，以改善小分子候選藥物的發現。篩選低分子量片段可以識別比 HTS 2具有更好效率和生理特征的命中化合物。

SPR 生物傳感器技術是篩選片段庫3的主要生物物理方法之一，因為盡管許多分析物具有低分子量和低親和力，但較新的儀器可實現足夠高的信噪比以生成可靠的數據。

在以前使用 SPR 建立 FBDD 測定的方法中，配體以高固定水平共價固定在傳感器表面上，以確保蛋白質穩定地結合到傳感器芯片表面。或者，將生物素化的蛋白質固定在鏈霉親和素涂層的傳感器表面上，其固有缺點是分析物可能與鏈霉親和素發生非特異性相互作用。兩種固定方法都無法從傳感器表面去除結合的配體，這很關鍵，例如，當使用 GPCR 或其他敏感蛋白質時，這些蛋白質通常會在長時間的篩選活動中變性。

A)具有固定化His 6-標記融合蛋白的單個NTA基團的剛性羧甲基化葡聚糖水凝膠。

B)柔性HC水凝膠形成聚-NTA螯合“籠"，用于His 6-標記融合蛋白的高親和力固定。

圖 1. NiD（基于葡聚糖）和 NiHC（基于線性聚羧酸鹽的傳感器芯片涂層用于 His 6標記生物分子的可逆固定的比較。

為了使這組敏感分子可用于 FBDD，已經進行了各種嘗試以通過基于親和力的 His 6 /鎳-次氮基三乙酸 (NTA) 偶聯來可逆地固定它們（圖 1）。先進的 NTA 傳感器芯片基于用 NTA 基團修飾的羧甲基葡聚糖 (CMD) 水凝膠。由于 His 6 -標簽和 Ni 2+ -NTA-復合物之間的親和力相對較低，配體從傳感器芯片表面連續解離會導致不需要的基線漂移。在篩選小分子時，這種漂移效應很容易超過特定信號，因此是一個主要問題。

圖 2. 比較NiD 和 NiHC 傳感器芯片上His 6標記融合蛋白 (59.7 kDa; AbCam #ab52213) 的固定能力和穩定性的兩個傳感圖的疊加圖。兩種相互作用均基于擴散校正的 1:1 結合模型進行擬合。NiHC 上的固定顯示了大約。與固定在 NiD 傳感器芯片上的穩定性相比，穩定性提高了 200 倍。

為了解決這個缺點，XanTec的表面化學家開發了一種基于強水合且非常柔韌的聚羧酸鹽聚合物骨架的 poly-NTA 傳感器芯片水凝膠涂層。與標準 CMD-NTA 化學相比，這些具有30、200、1000和 1500 nm 厚度的新涂層可以將捕獲的 His 6標記配體的穩定性提高 2-3 個數量級，與最近開發的 Tris-NTA 4。

圖 3. His 6標記蛋白 A/G 融合蛋白與單 NTA 衍生羧甲基葡聚糖（上）和 XanTec 的聚 NTA 傳感器芯片（下）的相互作用/親和性圖譜。從右上角到左下角增加親和力。親和力圖是使用 EvilFit 5通過結合/解離速率常數計算的。

圖 2 和圖 3 顯示了在XanTec 的poly-NTA 表面 NiHC1000M 上捕獲的 His 6標記配體（蛋白質 A/G 融合蛋白）比在 NTA 衍生的 CMD 水凝膠（單 NTA）上更高的穩定性。盡管該表面具有高親和力，但再生條件 (EDTA) 是溫和的，與標準單 NTA 傳感器芯片的條件相同。

Byun 等人的出版物 6 生動地證明了多齒高親和力 Ni-NTA 表面在小分子 SPR 測量中的有效使用。直接結合試驗用于研究 cGMP (345 Da) 和 cGMP 類似物 (8-NBD-cGMP, 605 Da) 與惡性瘧原蟲( Pf PKG)的 cGMP 依賴性蛋白激酶結合的動力學，該蛋白激酶與瘧疾相關寄生蟲。即使在高固定能力下，使用的XanTec bioanalytics高親和力 NiHC NTA 傳感器芯片也沒有顯示出浸出效應，因此可以評估遠低于 10 RU 的 R最大值（圖 4）。

圖 4. cGMP 和 8-NBD-cGMP 與 PfPKG 催化結構域（殘基 401-853）結合的表面等離子共振分析顯示出相似的結合動力學。通過在 XanTec bioanalytics 高親和力 NiHC NTA 傳感器芯片上捕獲多組氨酸標記的Pf PKG 401–853 并注入 cGMP (345 Da) 稀釋系列 45 s (A)或 8-在 Biacore™ 上進行直接結合測定NBD-cGMP (605 Da) 70 秒(B)。采用 Langmuir 1:1 模型進行數據擬合。

結論

與 NTA 衍生的羧甲基葡聚糖相比，使用XanTec*的 poly-NTA 傳感器芯片（NiHC 組），可以建立更高的固定化水平，并具有顯著減少浸出的額外好處，從而實現幾乎無漂移的基線。這允許在擴展的 FBDD 活動期間重復固定敏感配體，因為 NiHC 芯片表面在許多相互作用周期中是*可再生的。